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葉綠素a的測定方法——乙醇+分光光度法

1、水樣的保存水樣注入水樣瓶后，應放置在陰涼處，并避免陽光直射。若水樣的進一步處理需要較長時間（大于12h），則應置于0℃~4℃低溫下保存。水樣量視水體中浮游植物多少而定，一般應采0.5~2L。

2、抽濾在抽濾裝置的濾器中放入GF/C濾膜。抽濾時負壓應不大于50kPa。抽濾完畢后，用鑷子小心地取下濾膜，將其對折（有藻類樣品的一面向里），再用普通濾紙吸壓，盡量去除濾紙上的水分。如不立即提取，應將濾膜放在黑暗低溫條件下保存。在普通冰箱冷凍室中可存放幾天，在-20℃低溫冰箱中可保存30天。

3、提取研磨可用玻璃研缽。將濾膜剪碎放入研缽，加入90%乙醇溶液7~ 8ml，研磨3~5分鐘直至變?yōu)閯驖{。將研磨后的勻漿移入具塞帶刻度的離心管中。用少量提取液沖洗研缽或勻漿器，沖洗液并入離心管中，使終容積略小于10ml。蓋上關塞，搖動后置于黑暗低溫處進行提取至少6-24h。

4、離心將裝有提取液的離心管放入離心機中，轉(zhuǎn)速3500~4000rpm，離心10~15min。將上層葉綠素提取液移入定量試管中，再用少量提取液清洗、離心二次取得提取液。將提取液定容到10ml。如果大批樣品需同步操作時，可減少離心步驟，直接在提取液中浸泡濾膜6-2 4h，取其清液即可。

5、測定用90%乙醇溶液作為參照液（參照比色皿中盛放90%乙醇溶液，并用90%乙醇調(diào)分光光度計零點）。測定定容后的提取液在665nm和750nm處的吸光度，并計算兩個吸光度的差記為A1；然后向比色皿中加入1滴1mol/L的鹽酸酸化，酸化5—10min(可以用不同時間實驗再進行調(diào)整)后再次測定酸化后的提取液在665和750nm處的吸光度，并且把酸化后的兩個吸光度的差記為A2.則提取液中葉綠素a的濃度為：Chla=27.9×（A1－A2）×V提取液/V脫鎂葉綠素濃度為：Chla=27.9×（1.7 A2－A1）×V提取液/V其中Chla為水樣中的葉綠素a含量，單位為ug/L；V提取液為提取液的最終定容體積,單位為mL；V為抽濾水樣的體積，單位為L。