EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液（24765）產(chǎn)品描述
EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液（核心成分為線(xiàn)性聚乙烯亞胺，也稱(chēng)作LPEI），是新一代的轉(zhuǎn)染試劑，帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。除了具有陽(yáng)離子脂質(zhì)體（如：Lipo2000,3000）的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡(jiǎn)單，適用范圍廣，重復(fù)性好等特點(diǎn)外，經(jīng)李記生物優(yōu)化處理，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)。
EZ Trans（貨號(hào)：C4058L1092）核心成分Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000（PEI Max 40,000）, PEI Max 40,000是線(xiàn)性化聚乙烯亞胺PEI 25,000的升級(jí)產(chǎn)品，不同之處在于1）*水解（去乙?；?）比PEI25，000的鹽酸鹽形式，具更高的水溶特性；3）含更長(zhǎng)連續(xù)性乙烯亞胺（ethyleneimine）片段，其質(zhì)子化氮水平比PEI 25,000提高11%以上。Thomas M，et al（2005）研究數(shù)據(jù)表明，去乙?；腜EI 40,000（Polyethylenimine MAX 40,000）體外質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率提高21倍，小鼠體內(nèi)靶向效率達(dá)到10,000倍，肺部特異療效顯示增強(qiáng)1500倍。本品經(jīng)堿中和后，可轉(zhuǎn)化為線(xiàn)性化自由胺（PEI），此時(shí)分子量正相當(dāng)于25,000。PEI 23966與PEI 24765在轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞及DNA時(shí)是各有優(yōu)勢(shì)，李記生物提供的EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液（C4058L1080，C4058L1090）核心成分PEI經(jīng)過(guò)優(yōu)化，顯著降低了細(xì)胞毒性。
EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液（24765）使用方法
1. 接種細(xì)胞：用膠原酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)（不建議用*）。轉(zhuǎn)染前 18-24 小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞的鋪板，以便在轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞的密度大約在 80%左右。注：培養(yǎng)液中的血清和抗生素不影響轉(zhuǎn)染效率。
2. 準(zhǔn)備 EZ Trans-DNA 復(fù)合物
1）轉(zhuǎn)染前將所有試劑置于室溫 10 分鐘。下面，以轉(zhuǎn)染 24 孔板培養(yǎng)皿為例，說(shuō)明轉(zhuǎn)染的具體方法（如果在別的培養(yǎng)器皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，各試劑建議使用量見(jiàn)表 1.：
2）將 1 μg 質(zhì)粒 DNA 稀釋到 40 μL 無(wú)血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基，用移液槍吹吸 3-4 次。
3）將 3 μL EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑稀釋到 40 μL 無(wú)血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基，用移液槍吹吸 3-4 次。
注： 無(wú)血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基是稀釋液， 不能使用含血清的培養(yǎng)基（ 包括 Opti-MEM） 進(jìn)行 DNA 和 EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑的稀釋?zhuān)∫驗(yàn)?EZ Trans-DNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成過(guò)程不能含有血清。
4）將稀釋好的 EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑一次性全部加入到已稀釋好的質(zhì)粒 DNA 中，立即用移液槍吹吸 3-4 次。
注： 此混合的順序不能反向進(jìn)行！
5）室溫放置 10-15 分鐘，以形成 EZ Trans-DNA 復(fù)合物。
表1：不同培養(yǎng)體積對(duì)應(yīng)的待轉(zhuǎn)DNA、EZ Trans、稀釋液用量
3.轉(zhuǎn)染細(xì)胞
1）將上述 80 μL EZ Trans-DNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴入到含細(xì)胞的培養(yǎng)皿中。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿或輕微渦旋，讓 EZ Trans-DNA復(fù)合物分散均勻。
2）在 CO2 培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后 12-18 小時(shí)，去除含 EZ Trans-DNA 復(fù)合物的培養(yǎng)液。（若細(xì)胞形態(tài)欠佳，可在轉(zhuǎn)染 3-5h 后，添加 1/2 體積的包含 30%血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染 12-18 小時(shí)后*去除含 EZ Trans-DNA 復(fù)合物的培養(yǎng)液，用含血清和抗生素的新鮮培養(yǎng)液。）
3）轉(zhuǎn)染后zui快 7h 即可檢測(cè)到轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)，可根據(jù)需要在 24-48 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
注： 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株， 可在上述操作后（ 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 24 小時(shí)后） ， 將細(xì)胞傳代至新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中（ 將細(xì)胞稀釋 10 倍 以上） ， 在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃孵育過(guò)夜。 在有轉(zhuǎn)染抗性基因相匹配的藥物篩選條件下， 約 1——2 周可篩選到耐藥性克隆， 在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液（24765）運(yùn)輸與保存方法
常溫運(yùn)輸，4℃保存，保質(zhì)期12個(gè)月。
使用注意事項(xiàng)
質(zhì)粒質(zhì)量：請(qǐng)務(wù)必使用高質(zhì)量轉(zhuǎn)染級(jí)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒。通過(guò)260 nm光吸收測(cè)定DNA 濃度，260nm / 280nm比值確定 DNA 純度（比值應(yīng)該在1.8——2.0的范圍之內(nèi)）。如有可能，請(qǐng)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒的完整性。
細(xì)胞條件：使用適當(dāng)保存和經(jīng)常傳代的健康細(xì)胞。確保培養(yǎng)基沒(méi)有被細(xì)菌、真菌或支原體污染。如果細(xì)胞是近期復(fù)蘇的液氮凍存細(xì)胞，請(qǐng)?jiān)谵D(zhuǎn)染前至少傳代兩次。建議使用GIBCO或者李記生物的胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞。„
特別提醒
1. 對(duì)于某些類(lèi)型的細(xì)胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前兩天鋪板可顯著提高轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)水平。如果選擇轉(zhuǎn)染前兩天鋪板，可適當(dāng)降低鋪板密度，以確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度仍為70——80%。
2. 對(duì)于接觸抑制敏感的細(xì)胞，可適當(dāng)降低鋪板密度。
3. 即使在有蛋白（如10%的血清）存在的情況下，DNA-PEI復(fù)合物仍能轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但是DNA-PEI復(fù)合物必須在無(wú)蛋白存在的條件下形成。
4. 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)而言，每 1μg DNA 使用 3.0μL EZ Trans試劑都能獲得較高轉(zhuǎn)染效率。使用者也可嘗試每 1μg DNA使用 1——4μL體積線(xiàn)性PEI轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行優(yōu)化。
EZ Trans轉(zhuǎn)染液用于不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)用量參考（以96孔板為例）
附：幾種細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法比較
幾種細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法（試劑）特點(diǎn)比較表
轉(zhuǎn)染方法 | 原理 | 主要應(yīng)用 | 特點(diǎn) |
陽(yáng)離子聚合物
（EZ Trans） | 帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 | 除了具有陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡(jiǎn)單，適用范圍廣，重復(fù)性好等特點(diǎn)外，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)，是新一代的轉(zhuǎn)染試劑。 |
陽(yáng)離子脂質(zhì)體法 | 帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電核結(jié)合；另一種解釋是通過(guò)細(xì)胞是內(nèi)吞作用而被進(jìn)入細(xì)胞。(若DNA濃度過(guò)高，中和脂質(zhì)體表面電核，而降低了與細(xì)胞的結(jié)合能力) | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 | 使用方法簡(jiǎn)單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類(lèi)型的裸露DNA或RNA，能轉(zhuǎn)染各種類(lèi)型的細(xì)胞，沒(méi)有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染 中有很高的效率，但在體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，這在很大程度上限制了 其應(yīng)用 |
DEAE-葡聚糖法 | 帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 | 相對(duì)簡(jiǎn)便、重復(fù)比磷酸鈣好,但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副 作用,轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清且一 般只用于BSC-1,CV-1,COS 細(xì)胞系 |
磷酸鈣法 | 磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 染瞬轉(zhuǎn)染 | 不適用于原代細(xì)胞（所需的DNA濃度較高）,操作簡(jiǎn) 便但重復(fù)性差,有些細(xì)胞不適用 細(xì)胞建議用CSCL梯度離心，轉(zhuǎn)染是拷貝數(shù)較多 |
逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA) | 通過(guò)病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受 體相互作用而進(jìn)入宿主細(xì)胞，之后反轉(zhuǎn)入酶 啟動(dòng)合成DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 特定宿主細(xì)胞 | 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等,但攜 帶基因不能太大（<8kb）, 細(xì)胞需處分裂期,需考慮安全因素 |
腺病毒 (雙鏈 DNA) | 先和細(xì)胞表面的受體結(jié)合，繼 而在αv整合素介導(dǎo)下被細(xì)胞內(nèi)吞 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 特定宿主細(xì)胞 | 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,需考慮安全因素 |
Biolistic顆粒傳遞法（基因槍粒子轟擊法） | 將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì) 胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達(dá) | 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 | 可用于：人的表皮細(xì)胞， 纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以 及原代細(xì)胞 |
顯微注射法 | 用顯微操作將 DNA直接注入靶 細(xì)胞核 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 | 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限,多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的 胚胎細(xì)胞 |
電穿孔法 | 高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過(guò)膜上形成的小孔導(dǎo)入 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞 | 適用性廣，除了質(zhì)粒外，還可轉(zhuǎn)染大的基因組 （>65kb）但細(xì)胞致死率高， DNA和細(xì)胞用量大， 需根 據(jù)不同細(xì)胞類(lèi)型優(yōu)化電穿 孔實(shí)驗(yàn)條件，拷貝數(shù)較少 1-20 |
